transwell實驗

transwell實驗：
一類有通透性的杯狀的裝置；其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，杯子底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜）。該膜微孔的大小在0.1－12.0µm之間。
Transwell放入培養(yǎng)板后，分為兩室：Transwell小室內(nèi)稱上室，盛裝上層培養(yǎng)液；培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，盛裝下層培養(yǎng)液。上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。

應用
細胞種在上室內(nèi)，因聚碳酸酯膜有通透性，故可研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
根據(jù)transwell的特點（孔徑，膜），可進行如下方面研究：
1.共培養(yǎng)                   孔徑<3.0um
研究下室細胞B代謝物（分泌物）對上室細胞A的影響。
2.細胞趨化               孔徑可選擇5.0、8.0、12.0µm
研究進入下室的細胞量，反映下室成分對上室細胞的趨化能力
3.細胞遷移               孔徑常選擇8.0、12.0µm
研究進入下室的細胞量，反應上室細胞的遷移能力
4.細胞侵襲               孔徑常選擇8.0、12.0µm，膜上室側(cè)鋪有基質(zhì)膠，
研究進入下室的細胞量，反映上室細胞的侵襲能力

具體應用例子
一、腫瘤細胞侵襲實驗（transwell）
原理：
模仿體內(nèi)細胞外基質(zhì)，細胞只有分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解基質(zhì)膠才可進入下室。

步驟
1.  Transwell小室準備
1）無基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 包被基底膜：
A. Matrigel (50mg/L)按1:8稀釋，無血清培養(yǎng)基作為稀釋液
B. 取適量加入Transwell小室中(24孔板transwell小室加100 ul)，4℃操作。
C. 37℃培養(yǎng)箱中，孵育4-5h（>5h）；出現(xiàn)“白色層"時，說明已經(jīng)變?yōu)楣虘B(tài)。

2）有基質(zhì)膠Transwell小室制備
A. 小室放入培養(yǎng)板中，上室加入300µl預溫的無血清培養(yǎng)基
B. 室溫下靜置15－30min，使基質(zhì)膠再水化
C. 再吸去剩余培養(yǎng)液。

2．細胞懸液準備
1）消化、收集細胞；
2）PBS洗1－2次
3）用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸（細胞密度約在1－10×105/ml）。

3. 細胞接種
1）取適量細胞懸液加入Transwell小室（按transwell說明）。24孔板小室一般200µl。
2）24孔板下室一般加入500µl含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。注意避免氣泡產(chǎn)生（下層培養(yǎng)液和小室間）
3） 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。

4. 結(jié)果統(tǒng)計
檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：
1 ) 直接計數(shù)法
“貼壁"細胞計數(shù):
“貼壁"是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去。 通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞
A. 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞
B. 染色：常用的0.1%結(jié)晶紫染色。
優(yōu)點：(1) 不需固定細胞，直接染色即可。
(2) 配制簡單方便。
(3) 可以用33%醋酸脫色，測量洗脫液OD570值，間接反映細胞數(shù)
注意，染色前要將膜風干，否則可能會染不上。
C. 細胞計數(shù)：
(1) 顯微鏡進行觀察和拍照
(2) 取3-5個視野計數(shù)細胞個數(shù)

2) 間接計數(shù)法
用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)。
MTT法
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞
B. 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的培養(yǎng)基，將小室浸沒于其中，置于37℃2-4h后取出。
C. 24孔板中加入500µl DMSO，將小室浸沒于其中，振蕩結(jié)晶充分溶解。
D. 取出小室，測所得DMSO的OD值。
結(jié)晶紫檢測
A. 棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞
B. （可選）甲醛固定30分鐘，室溫
B. 24孔板中加入500µl  0.1%結(jié)晶紫溶液，將小室浸沒于其中，室溫放置20分鐘
C. 24孔板中加入500µl 33%醋酸，將小室浸沒于其中，脫色。
D. 取出小室，測量洗脫液OD570值。
優(yōu)點：染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。

5. 注意點
①Transwell小室：
注意是否是預先鋪好膠
② 上層培養(yǎng)液：
上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，一般加入0.05%-0.2% BSA。
③ 細胞：
有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。
④ 基質(zhì)膠：
常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel
⑤ 下層培養(yǎng)液：
下層常用含5%－10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當提高FBS濃度。
⑥ 細胞培養(yǎng)板：
細胞培養(yǎng)板應當與購買的Transwell小室相配套。

二、腫瘤細胞遷移實驗（Transwell）
過程與Transwell侵襲實驗基本*，不同的只是不需要鋪Matrigel。
步驟
1.Transwell放入預先每孔加有600ul的培養(yǎng)基（含10%血清）的24孔板內(nèi)，
2.在Transwell的內(nèi)室加入細胞（100ul,用含0.1%血清的培養(yǎng)基稀釋到所需密度），
3.放入細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間后取出。
4.取出Transwell，用棉簽擦去膜（內(nèi)室一側(cè)）的細胞
5.另一面的細胞用甲醛室溫固定30分鐘
6. 結(jié)晶紫染色20分鐘，
7. PBS或清水洗3次，
8.顯微鏡下觀察細胞，記數(shù)。