1.迅速滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。

以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：

1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。

2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以瞬間令RNA酶失活。

3）立即將樣品置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片要夠?。?/span><0.5cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。

2. 低濃度RNA的沉淀

純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀（加0.1體積的5M醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時(shí)，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓?/span>DNA污染，糖原含量高會(huì)抑制PCR反應(yīng)。酵母RNA和未處理的糖原會(huì)給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。

3.破壁方法

細(xì)胞或組織的勻漿對(duì)RNA提取來說，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過簡(jiǎn)單的渦旋震蕩來勻漿；而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細(xì)菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細(xì)胞壁，就需要溶菌酶消化來實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞裂解和RNA的大回收。酵母和革蘭氏陽性菌通常還需要液氮研磨過程中加入玻璃微珠幫助破壁，酵母提取也可以加入諸如Lyticase等破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進(jìn)行提取。